【生物类似药纵览】生物类似药的细胞培养

抗体类生物药是迄今为止临床应用最广的治疗性蛋白药物，其具有临床用药剂量大且需要规模化生产来满足市场需求的特点。目前的抗体类药物主要是通过中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养来表达生产。随着人口老龄化日益加剧，加之饮食结构和外部环境的影响，肿瘤的发病率也呈现逐年上升的趋势，市场对生物药尤其是抗体类生物药的需求也越来越大。如何进一步提升生物类似药的产能，即如何提高细胞培养工艺的产量、如何进行规模化培养，成为生物类似药规模化生产中亟须解决的问题。

细胞培养表达系统

不同于化学合成药物，生物药的表达产生于真核或原核系统。原核系统主要是大肠杆菌，真核系统主要为哺乳动物细胞或昆虫细胞系。体外系统（无表达系统）的研究和使用也是近些年研究的另一方向和热点。

生物类似药表达系统需要尽可能与原研生物药表达系统相似，以保证与产品生物活性和稳定性相关的蛋白质修饰水平类似。生物药的首选平台是哺乳动物细胞表达系统。20世纪以来，哺乳动物表达系统的使用处于稳步发展中。一方面，生物大分子的结构及功能的复杂性越来越被关注，如需要特定的翻译后修饰（如糖基化修饰等），而这些修饰只发生在哺乳动物表达体系中。另一方面，在哺乳动物体系中，绝大多数的重组蛋白可以分泌至胞外，不需要通过添加裂解液来裂解细胞这一方式获取目的蛋白，与原核表达系统相比有明显优势。

在可用的哺乳动物细胞系中，CHO细胞是抗体药物生产的首选。相对于其他的细胞类型，CHO细胞成为抗体生产的主要宿主细胞的可能原因包括以下几点：

在无血清、无蛋白、化学成分限定的培养基中能悬浮培养且生长稳定；

因抗体特定结构，可以表达与人类相近似的翻译后修饰；

能进行基因改造，易得到经基因改造的单克隆，这些单克隆能够表达产量和质量满足需求的目的蛋白；

分离纯化难度较低；

具有一定的安全性，尤其是在人类的致病性病毒方面。

然而，因为抗体的糖基化修饰在CHO细胞中与在人体细胞中并不完全相同，CHO细胞产生的重组蛋白可能会表现出免疫原性。这是在临床试验中需要关注的重点之一。

细胞培养的生产设备

大规模哺乳动物悬浮培养是使用大型生物反应器来实现的。反应器为哺乳动物细胞生长提供稳定可控的生长环境、有效的无菌隔离及气体、营养物质无菌供给，整体参考了微生物反应器（应用于细菌、放线菌、真菌等培养过程的反应器）的设计原理，同时根据哺乳动物细胞自身结构特点、培养工艺等进行了针对性的调整。按其结构和功能划分，反应器主要包括罐体和搅拌、温控系统、通气和排气、进出料、清洗（CIP）和灭菌（SIP）等模块。

罐体和搅拌

罐体作为反应器的主体结构，由不锈钢材质的筒体和上下封头组成一个密闭的结构，为满足可灭菌、易清洁的要求，与细胞和培养基直接接触的区域一般为316L不锈钢材质，表面粗糙度要求机械抛光至Ra=0.51μm后再进行电解抛光。由于反应器在使用前需要进行蒸汽灭菌，所以罐体耐压至少0.25bar。

搅拌系统包括电机、减速机、搅拌轴、机械密封、搅拌桨和挡板，其中搅拌桨为轴流形式（如marine桨、pitched桨）。

温控系统

生物反应器通过罐体外覆盖的夹套内液体循环实现热量的补充和散失。小型细胞反应器（100L以下）一般采用整体式夹套；大型生物反应器为提高夹套温度的均一性和热交换效果，往往采用蜂窝式夹套。温控循环中的液体通过循环泵提供动力，在换热器和夹套之间循环流动，最终实现通过控制循环液温度维持反应器罐体内温度的目的。

通气和排气

该模块的功能是为培养过程中的哺乳动物细胞生长代谢提供无菌空气、氧气、二氧化碳等气体并维持特定的培养压力。气体的除菌是通过标称孔径0.2μm的空气滤芯过滤。气体的流量控制往往是采用浮子流量计或更为精密的热质式质量流量计配合限流阀完成的。

进出料系统

包括进出液管道和阀组等，能够实现培养基、种子液、补料等溶液的无菌对接以及取样、转料等细胞液的无菌转移。可以通过设计一段能单独灭菌的管道完成连接工作，再对中间暴露过的接口进行灭菌从而实现无菌对接。

CIP和SIP

由于大型生物反应器管道复杂、罐体体积大，非常不利于手工清洁，应针对需要保持无菌状态的罐体和管道设计CIP和SIP的管道系统。CIP的关键在于冲洗的流量、冲洗的时间、清洗液的配方和清洗液温度；而SIP的关键在于灭菌温度和时间。

细胞培养工艺优化和放大

细胞培养方式可分为批培养、补料批培养、灌注培养和浓缩补料批培养等。补料批培养为目前应用最多的治疗性重组蛋白的培养方式。

工艺优化

当细胞株和培养基确定后，通常需要在小试规模进行细胞培养工艺参数的优化，为放大培养提供适合的操作范围，确保放大过程及产品质量的一致性。

细胞培养的工艺参数包括但不限于温度、pH、溶氧（DO）、二氧化碳分压（PCO₂）、通气和搅拌速率等。

培养温度是细胞培养过程的关键工艺参数之一，它可能影响细胞的生长、表达和产品质量。较低的培养温度可以减缓细胞的代谢、抑制细胞的生长，使得细胞在后期得以维持较高的活率，进而提高目的蛋白的产量。

适宜的pH是细胞生存的必要条件之一，低于6.7或高于7.4都会对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞蜕变或死亡。动物细胞合适的pH值一般在6.7~7.4之间，在此范围内，较高的pH会促进初始细胞的生长，但会增加乳酸的积累，乳酸的大量积累不利于细胞活力的维持；低pH环境可有效抑制乳酸的产生，但过低的pH会抑制细胞生长。

细胞培养过程中，DO可能对细胞生长和产物表达产生影响，通常认为动物细胞培养适宜的DO控制范围为≥20%，设定值在20%~50%既可以保证细胞正常代谢所需、减少乳酸的产生，又可以避免因DO过高引起的细胞毒性。

工艺放大

细胞培养工艺放大过程可能会是一个不断试错的过程，通常需要依靠具有丰富的放大经验和对设施设备参数充分了解的研究人员的参与和探索，并辅助以多批次小试研究数据的积累，在此基础上进行放大生产，从小试规模（摇瓶或2L反应器等）到几十升（如20L、30L或50L）、上百升（如150L或200L），再到商业化生产规模（2000L、6000L或更大规模）。

培养过程的关键工艺参数如温度、pH和DO等，可以参考小试实验积累的数据，使用线性放大原则进行放大。但气体传质无法按体积增加的比例进行线性放大。气体传质主要依靠搅拌和通气来实现，二者均会带来剪切力的问题。增加的剪切力可能直接影响细胞的生长（细胞密度、活率等）和表达。这时，就需要引入小试模型进行相应的放大参数研究，对生产放大过程给予指导，提高放大的成功率，确保放大后的细胞生长、代谢、表达及产品质量与小试规模的研究一致。

工艺放大过程的另一个参数是PCO₂。通常大规模生产过程中，因为罐体较高、培养体积较大，PCO₂往往高于小试规模数值。有时，会出现商业化规模生产的PCO₂大于120mmHg的情况。这种情况下，细胞的生长代谢会受到抑制，进而影响目的蛋白的表达和产品质量的一致性。因此，放大培养过程中应及时将产生的CO₂排出，以减少对细胞生长的影响。

（摘编自《生物类似药从研发到使用》，中国医药科技出版社出版）