【生物类似药纵览】检测药物浓度的生物分析方法

有了前期在生产工艺和体外药学部分的研究和比对，加上合理的动物实验设计为生物类似药的评价打下了牢固的基础，开发合适的生物分析方法成为评价药物在体内作用的关键。

在生物类似药的非临床研究中，生物分析方法的选择有别于创新药物，在满足获得生物基质中目标物质浓度数据的同时，还需要为生物类似药和参照药之间的相似性提供数据支持。

根据生物分析方法检测物质所发挥作用的不同，可以将其概括分为两大类：用于生物类似药PK（药代动力学）或TK（毒代动力学）的检测药物浓度的生物分析方法；用于生物类似药在体内免疫原性评价的检测抗药抗体的生物分析方法。针对不同的检测目的，生物分析方法的选择有着各自不同的考量点。

方法的开发

对于生物类似药的药代动力学研究，在试验设计中除了要考察候选药在体内的吸收分布特点外，还需要着重考察候选药和参照药在吸收分布方面药代动力学行为的可比性。

在同一套试验体系下，往往需要采用相同的生物分析方法完成PK与TK样品的检测。因此，在选择生物分析方法时，既需要兼顾PK研究中因为剂量较低产生的高灵敏度需求，又需要兼顾TK研究中因药物浓度过高造成的大倍数样品稀释的需求。

在测定药物浓度的生物分析方法中，可以采用多种检测模式来满足样品中药物浓度检测需求。根据检测药物存在形式的不同，可以分为游离型药物检测和结合型药物检测。

游离型药物检测方法所检出的药物是在基质中未与靶点结合的药物形式，而结合型药物检测方法测定的药物是部分或全部地结合了靶点的药物。在PK研究中往往更加关注游离型药物；在TK研究中则更加关注药物的暴露情况，因此会侧重结合型药物的测定。

一般而言，如果靶点在基质中不是游离型靶点，而是结合在膜上的靶点，两种检测方法所得到的结果基本等同。根据检测方法是否特异性针对药物与靶点结合区域设计，又可以将生物分析方法分为通用型方法和特异型方法。

在测定药物浓度的生物分析方法设计中，需要同时对候选药和参照药进行检测，有两种解决方案。

第一种方案是分别以候选药和参照药为标准品和质控样品建立两套方法，每套方法只用于一种药物的测定。即以参照药为标准品和质控建立的方法只用于参照药的测定，以候选药为标准品和质控建立的方法只用于候选药的测定。

第二种方案是以候选药为标准品建立一种方法，配合各自的质控样品同时针对参照药和候选药进行测定。采用这个方案建立方法时，要在验证过程中考察方法对于参照药和候选药的验证参数，从药物浓度检测方法的角度去分析候选药和参照药的相似性。

从实际操作中的便利性、样品检测的工作量及最终数据的解读和比对方面考量，采用第一种方案既会带来较大的工作量，又使得最终分析得到的药物浓度数据因为来自不同的方法而难以对比。因此，往往采用第二种方案来进行全部样品的检测，既达到了降低工作量的目的，又使得最终得到的数据可以进行对比分析。当然，采用这一方案必须保证同一方法能够准确测定参照药和候选药在生物基质中的浓度。这个要求需在方法验证中考察并通过。

在药物浓度生物分析方法的开发过程中，需要进行粗略的线性范围测定、包被试剂和检测试剂的配比组合优化以及温育时间和温度的考量，逐步寻找在预估线性范围内最适合的包被试剂和检测试剂的配比组合、用量及最适合的温育时间和温度。以此作为试验条件进行方法学验证中要求的验证项的预试，以确定此最适试剂配比组合及其他试验条件是否可以满足方法学验证的要求。

一般而言，在方法开发过程中需要至少考察方法的最小稀释度、精密度和准确度，方法的选择性及稀释线性。

通过最小稀释度的考察，可以确定方法是否具有抗基质干扰的能力。通过精密度和准确度的考察，可以观测所选的试验条件是否足够稳定并且有良好的可重现性。通过选择性的考察，可以评估方法在不同个体基质中是否具有良好的适用性，以保证在不同的个体基质中均可达到足够的准确度。通过稀释线性的考察，可以评估方法是否有潜在的钩状效应以及是否具有良好的稀释后线性关系，以保证样品在需要稀释的情况下仍然可以准确地回算真实浓度。如果考察的验证项目均符合验证接受标准，那么方法开发就可以告一段落，进入正式的方法验证阶段。

对于生物类似药的方法开发而言，除了以上常规的考察项目外，在方法建立阶段还要用摸索出的试验条件进行候选药和参照药的充分对比，包括标准曲线定量范围内每个浓度点的逐一对比以及不同浓度质控样品的互相回算。只有达到候选药和参照药的标准曲线和质控样品可以在接受标准的范围内实现互相替换，才能说明候选药和参照药在浓度生物分析方法上的一致性。

由于生物药在制备过程中的复杂性，无法保证候选药和参照药细微结构的完全一致。因此，如果生物分析方法中无法达到相互替换性，可以通过再次优化试验条件的方式进行调整，包括调整包被试剂和检测试剂、调整线性范围、更改检测平台等方式。如果经过调整仍无法达到相互替换性，则需要回顾药学中“相似性比对”是否有问题。

方法的验证及使用

按照指导原则的要求，生物分析方法的基本验证项包括线性范围、精密度和准确度、灵敏度、选择性、特异性、稀释线性和样本稳定性。

在方法学验证中使用针对候选药的药物浓度检测方法，除了考量符合指导原则要求的基本验证项外，仍然需要加入一个特殊的验证项目。为了使用同一种方法进行候选药和参照药的检测，需要检测候选药物和参照药质控样品的交互精密度和准确度，用以证明在不同的分析批和不同的分析日期的情况下，生物分析方法对于候选药和参照药均具有相似的表现。

需要注意的是，在实际生物样品检测中，虽然标准曲线是用候选药配制的，但质控样品并不总是用候选药配制。在检测候选药给药组的样品时，采用候选药配制标准曲线和质控样品；而在检测参照药给药组的样品时，则需要采用候选药配制标准曲线，采用参照药质控样品的方式进行样品的检测。

（摘编自《生物类似药从研发到使用》，中国医药科技出版社出版）