由于生物药的结构和功能的复杂性，仅从药物浓度的角度来评价相似性是不充分的，也是不准确的。
生物药由于分子量大且结构复杂，容易被机体识别为异源性物质，往往会产生抗药抗体（ADA）反应，这反映了药物的免疫原性。免疫原性的产生有多方面的因素，其中包括产品因素、机体因素、治疗相关因素、生产相关因素等。免疫原性采用ADA作为评价指标，ADA检测时往往采用多层级的方法。
方法的开发
首先，使用一个灵敏、高效但具有一定假阳性率的筛选方法对所有样品进行筛选，以快速剔除其中的阴性样品，得到疑似阳性样品；接着，使用确证方法对筛选试验筛选得到的疑似阳性样品进行特异性确证，以得到真实的阳性样品；最后，可以通过半定量的滴度测定，确定阳性样品中ADA的相对含量（滴度）。
对于候选药的比对研究，结合药物浓度数据和免疫原性数据能够更加全面地反映候选药和参照药的相似性。在PK（药代动力学）研究中，由于往往采用单次给药，免疫原性并不能完整地反映出来。在TK（毒代动力学）研究中，虽然多次给药有助于充分暴露药物的免疫原性，但是毒性剂量下的给药又有可能因为药物暴露过高而导致影响ADA的检出。这些因素在免疫原性评估时均需要考虑。
ADA往往采用桥联方法进行检测，即同时采用待评价药物或标记后药物作为包被试剂和检测试剂来检测样品中存在的ADA。样品中存在的ADA通过与包被在固体载面上的药物和连接显色试剂的药物相结合形成桥联结构，以达到被检测的目的。最终读数的大小和样品中ADA含量的高低呈现正相关性。
由于免疫反应的个体差异，ADA在样品中是以多种免疫球蛋白种类、不同亚型及不同亲和力形式组成的混合物，无法像药物浓度分析时那样使用标准品。在免疫原性生物分析方法中，往往采用药物免疫动物得到的多克隆抗体作为阳性对照抗体，用以完成方法的建立和验证，并在样品检测环节作为方法的质控。
在ADA检测的免疫原性生物分析方法设计中，也需要同时考量候选药和参照药ADA的检测需求。因此，也有两种解决方案：一是分别对候选药和参照药的ADA建立针对两者的独特方法，并分别制备针对候选药和参照药的阳性对照抗体；二是以候选药建立一种针对候选药ADA的检测方法，仅制备针对候选药的阳性对照抗体，并在方法的建立和验证过程中考察方法对于参照药的验证参数，从免疫原性检测方法的角度去分析候选药和参照药的相似性。
从实际操作中的便利性、样品检测的工作量及最终数据的解读和比对方面考量，采用第一种方案（即两种方法）同样也会带来较大的工作量，需要建立两套生物分析方法并应用两套方法分别对样品进行检测，使得最终分析得到的ADA数据难以对比。因此，目前在候选药的免疫原性研究中的ADA检测往往采用第二种方案，即用一种针对候选药的ADA检测方法来进行全部样品的检测。这样既达到了降低工作量的目的，又使得最终得到的免疫原性数据可以在同一个方法的框架下进行对比分析。
在免疫原性生物分析方法的开发过程中，首先也进行粗略的灵敏度和耐药性测定，通过考察包被试剂和检测试剂的配比组合、温育时间和温度等试验条件，逐步寻找在预估线性范围内最适合的试验条件，进一步以该试验条件进行验证项的预测试，以确定此条件是否可以满足方法学验证的要求。
一般而言，在方法开发过程中需要至少考察样本的最小稀释度、方法的灵敏度及药物耐受、方法精密度，并采用约5～10个个体来考察方法的筛选和确证临界值的范围。通过方法的灵敏度及药物耐受的考察，可以观测所选的试验条件是否可以满足样品检测及法规要求的灵敏度，并能考察潜在的药物干扰是否会影响到阳性样品的检出。如果药物耐受浓度不能满足预估的检测需求，则需要采用合适的样品处理方式（吸附、酸化等）进行样品处理，用以提高方法的药物耐受度。
精密度的考察可以衡量所选的试验条件是否足够稳定并且有良好的可重现性。通过使用5～10个个体的样品来考察方法的筛选和确证临界值，可以评估方法在选择的试验条件下是否具有良好的适用性和较小的基质效应。如果考察的验证项目均可以符合验证接受标准，那么方法开发就可以告一段落，进入正式的方法验证阶段。
对于生物类似药的免疫原性分析方法开发而言，除了常规的考察项目外，在方法建立阶段还要用摸索出的试验条件进行候选药和参照药的充分对比，包括在不同阳性对照抗体浓度水平下对候选药和参照药的药物耐受水平的逐一对比。只有达到在不同阳性对照抗体浓度水平下候选药和参照药均具有可比的药物耐受性，才能说明候选药和参照药在免疫原性分析方法上具有一致性。
方法的验证及使用
在方法学验证中，除了考察指导原则所要求的基本验证项外，仍然需要加入一个特殊的验证项目。按照指导原则的要求，基本的验证项包括临界值的确定［筛选、确证和（或）滴度试验所分别对应的临界值］、精密度、方法灵敏度、选择性、药物耐受度和稳定性等。为了使用一种方法进行候选药和参照药免疫原性的检测，需要至少增加不同阳性对照抗体存在情况下对候选药物和参照药的药物耐受检测，用以证明不管采用哪种阳性对照抗体，生物分析方法对于候选药和参照药均表现出类似的药物耐受性。
在实际生物样品的检测中，通常采用候选药同时作为包被和检测试剂建立桥联方法，以针对候选药的阳性对照抗体作为方法质控，检测所有给药组的ADA。
（摘编自《生物类似药从研发到使用》，中国医药科技出版社出版）